干細(xì)胞來(lái)源的肝細(xì)胞：前景廣闊的研究HBV感染的新工具
乙型肝炎病毒（HBV）感染常導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌，是引起進(jìn)行性肝臟疾病的主要病因。遺傳特征研究發(fā)現(xiàn)，HBV的復(fù)制周期特異性地依賴于宿主物種類(lèi)型及其肝細(xì)胞。盡管用克隆的病毒基因組轉(zhuǎn)染肝腫瘤來(lái)源的細(xì)胞系后可實(shí)現(xiàn)HBV復(fù)制和病毒顆粒組裝，然而只有在人原代肝細(xì)胞(PHH)或樹(shù)鼩原代肝細(xì)胞內(nèi)才能獲得完整的全病毒復(fù)制周期，包括通過(guò)受體介導(dǎo)的病毒穿入、將核殼體轉(zhuǎn)送至細(xì)胞核、rcDNA修復(fù)和cccDNA的形成。直到2002年Gripon等先獲得HBV易感細(xì)胞系，他們從一名HCV感染患者的肝臟中培養(yǎng)出肝祖細(xì)胞系(HepaRG)，再經(jīng)特定的培養(yǎng)條件分化后獲得HBV的易感性。該培養(yǎng)條件包括一個(gè)為期四周的分化過(guò)程，終獲得膽管樣細(xì)胞和肝樣細(xì)胞(HLC)。后者和PHH相似，表達(dá)肝細(xì)胞特異的標(biāo)記物，如細(xì)胞色素P450和人白蛋白等。HepaRG細(xì)胞分化后對(duì)HBV具有易感性，說(shuō)明分化的細(xì)胞表達(dá)了HBV受體，但當(dāng)時(shí)并不清楚HBV受體是什么。十年之后，北京的李文輝小組發(fā)現(xiàn)鈉-牛磺膽酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)正是長(zhǎng)期以來(lái)一直在探索的HBV受體，HepaRG細(xì)胞分化后也確實(shí)誘導(dǎo)了NTCP的表達(dá)。
另一條探索獲得HBV易感細(xì)胞系的途徑是對(duì)不同來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行分化，從而獲得HLC，如人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)、肝祖細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。利用hESC獲得HLC的方案通常包括三個(gè)關(guān)鍵步驟：(1)誘導(dǎo)內(nèi)胚層的生成，(2)肝細(xì)胞定向分化，(3)肝細(xì)胞成熟。2006年，Yamanaka及其同事通過(guò)將Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞而獲得了多能干細(xì)胞，這些重編程的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)可以分化為HLC。隨后出現(xiàn)了很多的優(yōu)化方案，這些方案均遵循一些相似的原則。簡(jiǎn)而言之，先通過(guò)激活素A和Wnt3a來(lái)誘導(dǎo)生成內(nèi)胚層，這一過(guò)程可通過(guò)免疫熒光法(IF)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子SOX17、FOXA2和GATA4進(jìn)行評(píng)估；其次，通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或化學(xué)制劑二甲基亞砜(DMSO）來(lái)誘導(dǎo)肝母細(xì)胞的形成，后者也可用于誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞的易感性，這一過(guò)程通過(guò)肝細(xì)胞核因子4(HNF4α)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、甲胎蛋白(AFP)和上皮細(xì)胞粘附分子(EPCAM)的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；后，在含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抑瘤素M的培養(yǎng)條件下將肝母細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化，該過(guò)程往往伴有脫唾液酸糖蛋白受體(ASGR)、白蛋白、細(xì)胞角蛋白18(CK18)和CYP3A4的表達(dá)。成熟HLC還具備尿素生成、吲哚菁綠(ICG)攝取和糖原存儲(chǔ)等肝細(xì)胞功能。此外，將HLC移植入動(dòng)物模型后可促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。目前沒(méi)有將HBV的易感性作為評(píng)價(jià)HLC功能的標(biāo)準(zhǔn)。
在之前進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，Shlomai等次證明HBV可以感染iPSC來(lái)源的HLC。該研究表明，在肝細(xì)胞成熟過(guò)程中，存在明顯誘導(dǎo)的NTCP表達(dá)，從而獲得對(duì)HBV的易感性，提示人iPSC來(lái)源的HLC可以應(yīng)用于HBV生物學(xué)研究。重要的是，該研究為從某些患者群體以及具有某種遺傳多態(tài)性的個(gè)體中獲得具有HBV易感性的細(xì)胞提供了研究方向。
美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的Jake Liang 等利用人ESC來(lái)源和人iPSC來(lái)源的HLC建立了有效可控的HBV體外模型，證實(shí)和拓展了上述發(fā)現(xiàn)。該小組利用他們之前建立的分化方案，在重編程的過(guò)程中對(duì)已知的肝細(xì)胞標(biāo)記物，如維甲酸X受體(RXR)、HNF4α和NTCP受體的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)所有相關(guān)標(biāo)記物都存在誘導(dǎo)性表達(dá)。而且，與PHH和HepaRG細(xì)胞相比，干細(xì)胞來(lái)源的HLC中誘導(dǎo)性NTCP表達(dá)水平更高。此外，在對(duì)PHH進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其N(xiāo)TCP迅速消失，而干細(xì)胞來(lái)源的HLC中NTCP的存在時(shí)間更長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)尤其重要，因?yàn)檫@是長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)病毒可以進(jìn)行傳播的先決條件。研究人員還確認(rèn)在HBV感染后，觀察到cccDNA生成、病毒RNA表達(dá)、HBsAg和HBeAg分泌以及病毒增殖等。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)HBsAg染色結(jié)果，當(dāng)使用300基因組當(dāng)量（mge）HBV時(shí)，約30%的干細(xì)胞來(lái)源的HLC可被病毒感染。與之前觀察到的PHH和HepaRG細(xì)胞以及表達(dá)NTCP的HepG2-NTCP相比，這種感染率頗為“低效”。然而，當(dāng)病毒負(fù)荷增加至1000 mge時(shí)，細(xì)胞感染率幾乎增加至100%。這一表現(xiàn)與PHH相似，且所有HLC亞群均有易感性。然而，HepaRG細(xì)胞在分化后有50%為不具有易感性的膽管細(xì)胞，且只有一個(gè)肝細(xì)胞亞群可被感染。因此，.0需要較高的病毒負(fù)荷來(lái)獲得高乙型肝炎病毒感染率未必是某一特定體外感染系統(tǒng)的缺陷，可能在一個(gè)擴(kuò)散速度有限的二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，將病毒從未成熟的形式轉(zhuǎn)化為可以結(jié)合NTCP的形式是一個(gè)較慢的過(guò)程（見(jiàn)表1）。
+號(hào)數(shù)代表抗原水平：++++，非常高；+++，高；++，中等；+，低；±，非常低。
評(píng)價(jià)欄：（+）和（-）分別代表正面和負(fù)面評(píng)價(jià)，（±）代表中立
Ni Y等一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是在終分化完成后HLC的易感性可持續(xù)達(dá)4周，這和PHH形成鮮明的對(duì)比。這一發(fā)現(xiàn)鼓勵(lì)了作者繼續(xù)研究如果培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)，允許HBV在感染后進(jìn)行多個(gè)周期的增殖，HLC是否可支持子代病毒的傳播。HBV病毒包膜源性抑制劑myrcludex B可干擾NTCP介導(dǎo)的HBV感染，作者通過(guò)長(zhǎng)期使用該抑制劑證實(shí)當(dāng)病毒侵入肝細(xì)胞的通路被阻塞后，該培養(yǎng)體系中病毒標(biāo)記物水平會(huì)顯著降低。此外，他們還采用免疫化學(xué)方法證實(shí)抑制劑可阻止鄰近感染細(xì)胞群的形成。目前尚未在其它細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果，該發(fā)現(xiàn)與移植PHH的uPA/SCID小鼠體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。值得注意的是，在培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)這種低水平的病毒傳播仍不足以達(dá)到對(duì)導(dǎo)入病毒進(jìn)行凈擴(kuò)增的要求。這與鴨HBV感染模型的結(jié)果明顯不同，在鴨原代肝細(xì)胞中可觀察到病毒凈擴(kuò)增。這可能反映了兩種病毒的侵入通路有明顯差別。因此，在未來(lái)的研究中很有必要將HLC置于三維培養(yǎng)環(huán)境中來(lái)觀察病毒傳播的水平是否增加。
為評(píng)估HLC是否適用于研究病毒-宿主相互作用以及藥物篩選，作者用siRNA先后沉默兩個(gè)已知的宿主因素NTCP和APOBEC3B，發(fā)現(xiàn)沉默關(guān)鍵宿主依賴因子NTCP使細(xì)胞易感性降低了2倍，而沉默宿主抑制因子APOBEC3B使HBV復(fù)制增加了約1.5倍。后，作者對(duì)HLC是否適合用于高通量藥物篩選進(jìn)行了研究，終篩出兩個(gè)潛在的抗病毒藥物，染料木黃酮和RXR拮抗劑PA452。
以上對(duì)hiPSC或hESC來(lái)源的HLC進(jìn)行應(yīng)用探索，為未來(lái)針對(duì)HBV復(fù)制周期的研究提供了非常重要的新型工具。為了將體外培養(yǎng)系統(tǒng)改善為更類(lèi)似于肝臟自然狀態(tài)（類(lèi)器官、三維培養(yǎng)、生物反應(yīng)器），很重要的一個(gè)方面是通過(guò)研究HLC的應(yīng)用來(lái)取代PHH，后者來(lái)源有限。后，對(duì)于直接修改干細(xì)胞系基因的研究進(jìn)展將對(duì)特異性宿主因素的研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，如從具有已知某種多態(tài)性或遺傳疾病的成人成纖維細(xì)胞中制備iPSC，將其轉(zhuǎn)化為個(gè)體特異的HLC，并用于乙肝病毒研究。
